丙酮酸脫羧酶（PDC ） 活性測定試劑盒說明書 紫外分光光度法

                                                                規(guī)格：50管/48樣

丙酮酸脫羧酶（ pyruvate decarboxylase,PDC ）活性測定試劑盒說明書

紫外分光光度法

注意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

PDC主要存在于酵母中，是乙醇發(fā)酵的關(guān)鍵酶之一，催化丙酮酸脫羧生成乙醛。

測定原理：

PDC催化丙酮酸脫羧生成乙醛，添加乙醇脫氫酶（ADH）來進一步催化 NADH還原乙醛生

成乙醇和NAD⁺；NADH在340nm有吸收峰，而NAD⁺沒有；通過測定340 nm光吸收下降速率，來計算PDC活性。

自備儀器和用品：

研缽、冰、臺式離心機、紫外分光光度計、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液槍和蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑四：粉劑×1 瓶，﹣20℃保存。

試劑五：液體×1 瓶，﹣20℃保存。

混合試劑：臨用前配制，小心把試劑四和五轉(zhuǎn)移到試劑三中，充分溶解。

試劑六：液體×1 瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

1、細菌或細胞處理：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每200萬細菌或細胞加入400μL試劑一，超聲波破碎細菌或細胞（功率200W，工作3s，間歇10s，工作35次），16000g 4℃離心20min，取上清，置冰上待測。

2、組織處理：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組

織，加入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿，16000g 4℃離心 20min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）等液體樣品：直接檢測。

PDC 測定操作：

1. 分光光度計預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于25℃水浴中預(yù)熱30min。

3. 空白管：依次在 1mL 石英比色皿中加入100μL蒸餾水、100μL混合試劑、700μL試劑二

和100μL試劑六，迅速混勻后于340nm比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為 A1 和A2。

4. 測定管：依次在1mL石英比色皿中加入100μL上清液、100μL混合試劑、700μL試劑二

和100μL試劑六，迅速混勻后于340nm 比色，記錄15s和75s的吸光值，分別記為A3和A4。

注意：空白管只需測定一次。

PDC 活性計算公式：

（1）按照蛋白濃度計算

活性單位定義：25℃中，每毫克蛋白每分鐘催化 1μmol NADH 氧化為 1 個酶活單位。

PDC (μmol/min/mg prot) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×10⁶ }÷(Cpr×V 樣) ÷T

=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計算

活性單位定義：25℃中，每克組織每分鐘催化 1μmol NADH 氧化為 1 個酶活單位。

PDC (μmol/min/g) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×10⁶ }÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T

=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：25℃中，每10⁴個細胞每分鐘催化1μmol NADH 氧化為 1 個酶活單位。

PDC (μmol/min/10⁴ cell) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×10⁶ }÷(細胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]÷細胞數(shù)量

（4）按血清（漿）體積計算

活性單位定義：25℃中，每毫升血清（漿）每分鐘催化1μmolNADH 氧化為1個酶活單位。

PDC (μmol/min /mL) ={[(A3－A4)－(A1-A2)]÷ε÷d×V 總×10⁶ }÷V 樣÷T

=1.61×[(A3－A4)－(A1-A2)]

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10 3 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 總：反應(yīng)體系總體

積，1mL=0.001L，V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.1mL；Cpr：蛋白濃度（mg/mL），需要另外測定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量試劑盒；W：樣本質(zhì)量，g ；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時間，1 min。

注意事項：

配制好的混合液 3 天內(nèi)使用完。